首 页 会员登录 下载中心 联系我们 企业邮局 繁體中文
 
新闻搜索
 
最新新闻
 ☉RNA的分离与纯化
 ☉RNA提取试剂(TRIzol)
 ☉BCA蛋白检测方法的原理及特点
 ☉Lowry法(Folin酚法)
 ☉分子生物研究的革命性技术-PC
 ☉Trizol试剂提取DNA的实
 ☉PCR技术的相关应用
 ☉近期促销活动
热门新闻
 ☉RNA的分离与纯化
 ☉RNA提取试剂(TRIzol)
 ☉BCA蛋白检测方法的原理及特点
 ☉Lowry法(Folin酚法)
 ☉分子生物研究的革命性技术-PC
 ☉Trizol试剂提取DNA的实
 ☉PCR技术的相关应用
 ☉近期促销活动
新闻分类
会员中心 留言簿 联系方式
 
  首页 >> 新闻资讯 >> 新闻内容  

RNA的分离与纯化
双击自动滚屏 发布者:dindin 发布时间: 阅读:9450

RNA的分离与纯化(真核细胞RNA的制备)

 

从细胞中分离RNA的纯度与完整性对于许多分子生物学实验至关重要。如Northern印迹及杂交分析、寡聚(dT)纤维素选择分离mRNAcDNA合成及体外翻译等实验的成败,在很大程度上决定于RNA的质量。

哺乳动物中,平均每个细胞内大约含有10-5 μg RNA 。理论上认为每克细胞可分离出510mg RNA,对于培养细胞而言,1g细胞相当于1 ml压积的细胞,大约108个细胞。

RNA 主要由以下几类分子组成:rRNA(占RNA 总量的80%~85 %)、tRNA 和核内小分子RNA(占10%~15%)、mRNA(占1 % 5 %)。

rRNA 在总RNA 分子中含量丰富,由28S 18S 5S 4S 几类组成,它们之间同源性大,分子量变化不大,所以可根据它们的密度和分子大小,通过密度梯度离心,凝胶电泳或离子交换层析进行分离。

mRNA 分子种类繁多,分子量大小不均一,在细胞中含量少,绝大多数mRNA 分子、(除血红蛋白及有些组蛋白mRNA以外),均在3ˊ端存在20250个多聚腺核苷酸poly(A)。利用此特征,可很方便地从总RNA中,用寡聚(dT)亲和层析柱分离mRNA。因为在物理特性上不均一的mRNA 分子群体编码细胞内所有的多肤和蛋白质,而mRNA 是分子生物学的主要研究对象之一。
RNA
分离的最关键因素是尽量减少RNA 酶的污染。

创造一个无RNase的环境

RNA酶,尤其是胰RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类。除细胞内RNase以外,环境中灰尘、各种试验器皿和试剂、人体的汗液、以及唾液中均存在RNase。这类酶耐热、耐酸、耐碱,如煮沸也不能使之完全失活,蛋白质变性剂可使之暂时失活,但变性剂去除后,又可恢复活性。RNase 的活性不需要辅助因子,二价金属离子鳌合剂对它的活性无任何影响,故在提取RNA时,应尽力减少RNA酶对RNA的降解作用。

 创造一个无RNase的环境主要包括两个方面的工作:即极力避免外源RNase的污染和尽力抑制内源性RNase的活力。前者主要来源于操作者的手、实验的器皿和试剂;后者主要来源于样品中的组织细胞。

4 . 5 . 1 . 1 去除外源性RNase的污染

(1)操作者的手直接触摸之处,毫无疑问会留下RNase,说话带出的唾液也富含RNase。故整个操作过程中,应戴口罩和手套。

(2)空气中飞尘携带的细菌、霉菌等微生物,也是污染外源RNase的一条途径,所以操作过程应在比较洁净的环境中进行。

(3)玻璃器皿常规洗净后,应用0.1 %二乙基焦碳酸盐(diethyl pyrocarbonate,DEPC)浸泡处理( 372小时),再用双蒸灭菌水漂洗几次。高压消毒去除DEPC ,然后250 供烤4小时以上或200干烤过夜。

(4)塑料器材最好使用灭菌的一次性塑料用品,Eppendorf管、微量加样吸头最好是新的,使用前进行高压消毒。

(5)所有溶液应加DEPC0.05%~0.1 %,室温处理过夜,或室温下磁力搅拌20分钟,然后高压处理(l.034×105Pa , 1530分钟);或加热至70 1小时或60过夜,以去除所有残留的DEPC

DEPC易与Tris反应,DEPCTris中的半衰期只有1.25 分钟,所以配制Tris溶液的水应先用0.1% DEPC处理,配液的用水亦应高压消毒,配好后再经高压消毒。

(6)严格地说,RNA 提取所使用的酚,应该单独配制和使用,在配制饱和酚用的盐溶液时,使用的水应预先以DEPC处理且高压消毒,酚饱和后,加入8-羟基喹啉至0.1% , 8–羟基喹啉不但抗氧化,且有一定的RNA酶抑制作用。

(7) RNA试验中使用的甲酰胺,应用5g/100mlAG 501-X8 (D)树脂彻底去离子,Whatman 1 号滤纸滤过后,然后以0.45 μm的滤膜滤过除菌。

(8)所用的化学试剂应为新包装,称量时使用干烤处理的称量勺,CaCl 晶体最好先经紫外线消毒,200干烤612小时。所有操作均应在冰浴中进行,低温条件可减低RNA酶的活性。

说明:

DEPC的分子式为C2H5-O-CO-O-CO-O-C2H5,为粘性液体,是很强的核酸酶抑制剂。作用机制是通过与蛋白质中的组氨酸结合,使蛋白质变性。DEPC也能与RNA 或单链DNA反应,破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环,但它破坏单链核酸的浓度要比使蛋白质变性的浓度大1001000倍。DEPCTris中,易分解成CO2和乙醇,使pH值下降。在0.1mol/L Tris·Cl,PH7.5,溶液中极不稳定,半衰期仅为1 .25分钟。DEPC 不能用聚苯乙烯器皿存放。保存在4或液氮中,可防止DEPC降解。DEPC0.11mg/ml的肝素联合使用,具有极强的RNase抑制效果。


4 . 5 . 1 . 2
抑制内源性RNase的活性

细胞裂碎的同时,RNase释放出来,这种内源性的RNase是降解RNA 的主要危险之一。所以原则上要尽可能早地去除细胞内蛋白,加RNase抑制剂,力争在提取的起始阶段对RNase 活力进行有效地抑制。

不同组织细胞中内源性RNase的数量不同,胰腺、脾组织细胞中RNase的含量极为丰富,在RNA提取时需要联合使用强有力的RNase抑制剂。

1 .低特异性RNase抑制物:

不同类型的低特异性RNase抑制物均可不同程度地抑制RNase的活性,其中包括皂土、Macaloid 、肝素、氧钒基-核苷复合物、多胺等,但都不能完全抑制RNase 的活性。在RNase特异抑制剂出现后,现在已不大使用。

(1)皂土(bentonite) :分子式为Al2O34SiO2·H2O是澎润的钠盐,带有负电荷,可以结合金属离子及包括RNase在内的碱性蛋白质。皂土用量要适宜,太多会吸附RNA分子,它对RNase的抑制作用与pH有密切关系,一般在溶液的pH值为6 .0时,需用皂土35μg/ml;而pH7.4,则需用皂土3500μg/ml才能有效地抑制酵母或胰脏中的RNase

皂土配制:皂土干粉以50mg/ml的浓度悬浮于灭菌蒸馏水中,分级离心,收集6000g10分钟和10000g15分钟部分;再用0.1mol/LpH7.5)的EDTA悬浮,25搅拌48小时以去除金属离子,然后如前分级离心。1000g ,离心的沉淀,用消毒水漂洗去除EDTA,最后将处理后好的皂土以5%的浓度悬浮于NaAcpH6.0)溶液中备用。加入RNA 提取液中的皂土与RNase结合后,可通过离心去除。

(2)复合硅酸盐(Macaloid) :Macaloid带负电荷,能吸附RNA酶和DNase 。对于真菌和植物组织,其抑制RNase 的能力强于比皂土。

Macaloid粉末悬浮于0.05mol/L Tris·ClpH7.6 )0.01mol/L MgAc )2溶液,用捣碎机高速捣碎5分钟,离心,沉淀,去除上清及下层粗颗粒沉淀,将成胶的中层取出,以终浓度为10mg/ml再悬浮于0.05mol/L Tris·Cl(pH7.5)溶液中备用。

一般使用浓度是:0.015 % ( W/V ) ,通过离心去除。

(3) DEPC 前面已有介绍。

(4)肝素:肝素是医学中常用的血液抗凝剂,为多糖类物质。使用0 .110g/ml肝素,在37 能抑制95%的RNase活力。免疫法制备mRNA时常用肝素。

(5)多胺:多胺类如精胺、肉胺和尸胺等对RNA 酶的活力也有一定的抑制作用。

(6)共聚酪氨酸-谷氨酸:在pH5.4时,该物质能有效地抑制RNA 酶的活力,但在pH7.4 ,则无抑制作用。

2 .去除蛋白质物质:

蛋白质变性剂、蛋白酶K 、阴离子去污剂,常与RNA 酶抑制物质联合使用,以加强对RNA酶活力的抑制。

(1)酚、氯仿:这类有机溶剂不但能使核蛋白质与核酸解聚,而且可以利用其对蛋白质的变性作用抑制RNase的活力。酚不能完全抑制对RNase的活性,但可溶解一定数量3ˊ端带有ploy(A)结构的RNA分子,其中加入0 .1 %的8-羟基喹啉,与氯仿联合使用可增强对RNase的抑制。重蒸酚在使用前需用相应缓冲液饱和,是为了减少核酸,(尤其是mRNA)的丢失。

蛋白酶K及其它蛋白质变性剂(如尿素)也能抑制RNase的活性。蛋白酶K 1%~2%的SDS 存在下,其活性反而会增加。

(2)去污剂:SDS 、十二烷酰肌氨酸钠(sarkosyl)、脱氧胆酸钠(DOC)是阴离子去污剂,不但可解聚核酸与蛋白质的结合,还可与蛋白质带正电荷的侧链结合,在高浓度KCl存在下,形成SDS-蛋白质复合物而沉淀。

SDS Na+浓度大于摩尔水平及高浓度CsCl溶液中容易析出,RNA 提取时若需CsCl 密度梯度超速离心法则不应使用SDS,而应改用sarkosyl,否则SDS的析出会破坏离心形成的CsCl梯度。

DOC的作用与SDS 相似,在乙醇中的溶解度比SDS的溶解度高。

(3)解偶剂(胍类):盐酸胍、异硫氰酸胍是一类强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白质,并使蛋白质二级结构消失,细胞结构降解,核蛋白迅速与核酸分离,所以又称解偶剂。在4mol/L异硫氰酸胍和β-巯基乙醇(破坏RNase 蛋白质中的二硫键)一类还原剂存在下,RNase 的活性极度地受到抑制,它们的使用能从胰腺这样富含RNase 的组织细胞中分离出完整的RNA分子,故目前这类物质成为制备RNA的常规试剂。

3 . RNase的特异抑制剂:

(1)RNase 阻抑蛋白(RNasin ) :这是一类从大鼠肝或人胎盘中提取出来的酸性糖蛋白质,鼠肝RNasin分子量为40kD ;来源于人胎盘的RNasin 分子量为51kD,等电点为4 .7,最适pH78RNasin 能与RNase非共价结合(Ki≈3×1010)从而抑制它们的活力,RNasin RNA 酶的一种非竞争性抑制剂。1mmol/L的二巯基乙醇对于RNasin发挥抑制RNase的最大活性非常重要。RNasin 最好不要与某些蛋白质变性剂(如7mol/L 尿素)同时使用,因为尿素能使RNAsin-RNase复合物分离,并释放出活性的RNase

RNasin贮存于50%甘油或5mmol/L二巯基乙醇溶液中,-20保存,反复冻融或贮存于有氧化剂的溶液中,RNasin。极易被破坏,不宜继续使用。RNasin对其它核酸工具酶无影响,对RNase有强的特异性抑制效果,很容易被酚抽提除去,故日益被广泛采用。常用于体外翻译体系、mRNA反转录合成cDNA及体外转录实验。RNasin可从Promega公司购买。

(2)氧钒核糖核苷复合物(vanadylribonucleoside complex) :这是BergerBirknmeier1979年发现的1RNA特异性抑制剂,该复合物由氧化钒离子与4种核苷之一形成。它们能与多种RNase结合形成过渡态类似物,几乎可完全抑制RNase的活性。在RNA制备中,使用浓度一般为10mmol/L 。提取的mRNA 产量很高,其质量能满足反转录实验,还可在蛙卵细胞中翻译合成蛋白质。氧钒核糖核苷复合物对mRNA的无细胞翻译系统具有很强的抑制作用,必须用含8-羟基喹啉饱和酚进行反复多次抽提,以去除之。前几次抽提时,酚相由黄色变为黑色,继续抽提,当黄色不再改变时,标志已被除尽。

 

盐酸胍-有机溶剂法

本法由MacDonald1987年在Strohman报道的方法基础上改进而成,适用于没有超速离心设施的情况下提取细胞总RNA。它利用盐酸胍抑制RNA 酶,匀浆裂解细胞,有机溶剂抽提去除蛋白质,通过选择性沉淀RNA 分子而去除DNA,提取的RNA质量较好,但整个操作过程繁杂费时。

注意事项:

若提取RNA的组织细胞样品曾被DNA 转染或被DNA 病毒感染过,RNA制品中可能含有这些DNA分子,它们会干扰RNA的翻译、cDNA合成、Northern杂交。应该加入无RNaseDNase I 至终浓度为2μg/ml37保温60分钟消化DNA 分子,纯化
 
 

打印本页 || 关闭窗口



人才招聘   |   下载中心   |   联系我们   |   客户留言   |   会员中心
Copyright © 2002-2013   上海荔达生物科技有限公司   最佳显示IE7.0 1024×768
地址:上海市浦东新区顾唐路138弄37号    邮编:201209
总机:021-61630382    值班经理:15901764072    E-mail:SALES@LAB-AIDE.COM

                                沪ICP备07507157号    QQ:32486445上海荔达经理为您服务     QQ:524549965上海荔达客服为您服务

pk10直播开奖结果